การย้ายฝากตัวอ่อน

การย้ายฝากตัวอ่อน

| |

องค์ความรู้เรื่องเทคโนโลยีชีวภาพ - การย้ายฝากตัวอ่อน

การย้ายฝากตัวอ่อน(Embryo Transfer : ET) 
               คือ  วิธีการเก็บตัวอ่อน  (embryos  หรือ  fertilized  ova)  จากทางเดินระบบสืบพันธุ์ของสัตว์เพศเมียที่เรียกว่า "ตัวให้" (donor)  ก่อนที่ตัวอ่อนจะฝังตัวแล้วดำเนินการย้ายให้ตัวอ่อนนั้นไปฝังตัวในทางเดินระบบสืบพันธุ์ของสัตว์  "ตัวรับ"  (recipient)  เพื่อให้ตั้งท้องแทนหรือที่เรียกว่า  "อุ้มบุญ"
               ปัจจุบันเทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อนได้แตกแขนงและพัฒนาเกี่ยวเนื่องกับเทคโนโลยีชีวภาพอื่น ๆ เพื่อการปรับปรุงพันธุ์สัตว์อีกหลายชนิด เช่น
               1.การแช่แข็งตัวอ่อน ไข่อ่อน ตัวอสุจิ
               2.การตัดแบ่งครึ่งตัวอ่อน
               3.การคัดเลือกเพศตัวอ่อน
               4.การปฏิสนธินอกร่างกาย
               5.การโคลนนิ่งหรือผลิตแฝดเหมือน
               6.การถ่ายฝากยีนหรือสารพันธุกรรม
               อย่างไรก็ตามเทคโนโลยีต่าง ๆ ที่กล่าวถึงนี้ เมื่อนำมาใช้เพื่อการผลิตและปรับปรุงพันธุ์สัตว์ก็ต้องสิ้นสุดด้วยวิธีการย้ายฝากตัวอ่อน คือต้องนำตัวอ่อนย้ายฝากไปสู่สัตว์ตัวรับในที่สุด   นอกจากนี้เทคโนโลยีการย้ายฝากตัวอ่อน ยังถูกประยุกต์ใช้เพื่อประโยชน์ในด้านต่าง ๆ ทั้งการแพทย์ เภสัชกรรม อุตสาหกรรม และการอนุรักษ์พันธุกรรม

ปัจจัยที่มีผลต่อความสำำเร็จในการย้ายฝากตัวอ่อน 
               1.  คุณภาพของตัวอ่อน  ต้องผ่านการประเมินคุณภาพแล้วว่าอยู่ในประเภทดีเยี่ยมหรือดี
               2.  ตัวรับ  ต้องมีรูปร่างดี  สุขภาพสมบูรณ์  พร้อมมีประวัติของระบบสืบพันธุ์ที่ดี  โดยเฉพาะอย่างยิ่ง  มีวงจรการเป็นสัดสม่ำเสมอ
               3.  เทคนิคและการปฏิบัติการของผู้ดำเนินการ  ต้องคำนึงถึงความสะอาดอย่างยิ่ง  และทำด้วยความนุ่มนวล ใช้เวลาดำเนินการน้อยที่สุด

ประโยชน์ของการย้ายฝากตัวอ่อน
               1.  เพิ่มจำนวนและขยายพันธุ์โค - กระบือ  ที่มีพันธุกรรมดี  ได้เร็วขึ้น  และมากกว่าโดยวิธีธรรมชาติ
               2.  ทำให้การคัดเลือกและปรับปรุงพันธุ์สัตว์เป็นไปได้รวดเร็วขึ้น โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อใช้ร่วมกับ MOET (Multiple Ovulation and Embryo Transfer) หรือ JIVET (Juvenile in vitro fertilization and embryo transfer)
               3.  ช่วยให้การขนย้ายสัตว์สะดวกขึ้น  และลดค่าใช้จ่ายโดยขนส่งในรูปตัวอ่อนแช่แข็ง  นอกจากนี้ยังทำให้การแพร่ของโรคติดต่อควบคุมได้ง่าย  และมีความปลอดภัยสูง
               4.  ช่วยในการอนุรักษ์พันธุกรรมสัตว์  ทั้งสัตว์พันธุกรรมดี  สัตว์หายาก  หรือสัตว์ใกล้สูญพันธุ์
               5.  ใช้ร่วมกับเทคโนโลยีอื่นๆ  เช่น  การโคลนนิ่ง  หรือการถ่ายฝากนิวเคลียส(nuclear transfer) การถ่ายฝากสารพันธุกรรม (genes transfer) เป็นต้น

ขั้นตอนการดำเนินการย้ายฝากตัวอ่อน
               1.การคัดเลือกตัวให้ (donor selection)
               2.การคัดเลือกตัวรับ (recipient selection)
               3.การกระตุ้นให้ตกไข่หลายใบ (super ovulation)
               4.การเหนี่ยวนำการเป็นสัด (estrus synchronization)
               5.การเก็บตัวอ่อน (embryo collection)
               6.การประเมินคุณภาพตัวอ่อน (embryo evaluation)
               7.การแช่แข็งตัวอ่อน (embryo cryopreservative)
               8.การย้ายฝากตัวอ่อน (embryo transfer)

การคัดเลือกตัวให้ (donor selection)
          ตัวให้ (donor) คือแม่โคที่มีลักษณะและพันธุกรรมดีที่ต้องการกระจายพันธุ์ หรือเพิ่มจำนวนให้มากขึ้นเกินกว่าที่จะเป็นไปได้ในทางปกติธรรมชาติของช่วงวัยเจริญพันธุ์ของสัตว์ โดยการเก็บตัวอ่อนจากตัวให้ซึ่งจะมีพันธุกรรมตามที่ต้องการ ข้อควรคำนึงถึงในการพิจารณาสัตว์ที่จะคัดเลือกมาเป็นตัวให้ คือ
               1.มีพันธุกรรมดี
               2.สุขภาพ ลักษณะกายวิภาคและสรีรวิทยา

การคัดเลือกตัวรับ (recipient selection)
           ตัวรับ (recipient) คือแม่โคที่จะให้ตั้งท้องแทนตัวให้ โดยตัวรับจพได้รับการย้ายฝากตัวอ่อนของตัวให้ดังนั้นตัวรับจึงมีความสำคัญมาก เพราะเป็นตัวอุ้มท้องตัวอ่อนที่ฝากเข้าไป ข้อที่ควรคำนึงในการคัดเลือกตัวรับ คือ
               1.พันธุกรรมและความสามารถในการให้นม  สัญชาตญาณความเป็นแม่และการคลอดง่าย 
               2.มีสุขภาพ ลักษณะกายวิภาคและสรีระวิทยาปกติ ปราศจากโรคถ่ายทอดทางพันธุกรรม  และโรคติดต่อทางระบบสืบพันธุ์

 

โคขาวลำพูน	โคพื้นเมืองภาคใต้

       

การกระตุ้นการตกไข่หลายใบ (super ovulation)
               1.กระตุ้นโดยการฉีดฮอร์โมน PMSG (Pregnant mare serum gonadotropin) โดยทั่วไปในโคจะฉีดกระตุ้นในช่วงวันที่ 8-14 ของวงรอบการเป็นสัดหรือฉีดหลังการเป็นสัด 10-12 วัน โดยใช้ขนาด 1,500-3,000 iu. เพียงครั้งเดียว และอาจฉีด PGF2∝(Prostaglandin F2∝) ขนาด 25 mg.หลังการฉีด PMSG 2 วัน โคจะแสดงอาการเป็นสัดประมาณ 2-5 วันหลังฉีด PGF2∝ ทำการผสมเทียมในชั่วโมงที่ 8 และ 20 หลังเป็นสัดยืนนิ่ง (standing heat)

กราฟแสดงช่วงเวลาที่เหมาะสมในการใช้ฮอร์โมนกระตุ้นการตกไข่

               2.การฉีดด้วยฮอร์โมน FSH (Follicle stimulating hormone) วันละ 2 ครั้ง เช้า-เย็น ติดต่อกัน 3-4 วัน โดยลดขนาดของฮอร์โมนที่ฉีดลงจะให้ผลกระตุ้นการตกไข่ได้มากกว่า ตัวอ่อนที่เก็บได้มีคุณภาพดีและเมื่อนำไปฝากจะติดตั้งท้องได้ดีกว่าการฉีดฮอร์โมนเพียงครั้งเดียวในขนาดฮอร์โมนที่เท่ากัน ตามปกติการกระตุ้นการตกไข่หลายใบในโค คือการตอบสนองในแต่ละตัวจะแตกต่างกัน บางตัวตกไข่น้อย อัตราการผสมติดต่ำ ทั้ง ๆ ที่การใช้ฮอร์โมนและการจัดการอยู่ในมาตรฐานเดียวกันแต่การตอบสนองไม่คงที่ จากขนาดฮอร์โมน 3,000 iu. ควรจะมีการตกไข่ถึง 10 ใบ แต่ตามความเป็นจริงจะมีความแปรปรวนตั้งแต่ 0-40 ใบ นอกจากนี้โคที่กระตุ้นการตกไข่หลายใบเมื่อทำซ้ำจะมีจำนวนไข่ลดลงเนื่องจากมีการสร้างสารต้านฮอร์โมน

โปรแกรมกระตุ้นการตกไข่หลายใบในแม่โคตัวให้ (Donor)

 

การเหนี่ยวนำการเป็นสัด (Estrus Synchronization)
               ในการดำเนินการย้ายฝากตัวอ่อน จะต้องเก็บตัวอ่อนจากแม่ตัวให้ (donor) ที่มีตัวอ่อนอายุประมาณ วันที่ 7 แล้วย้ายฝากให้แม่ตัวรับ (recipient) ที่มีสภาพของมดลูกเป็นวันที่ 7 ของวงจรการเป็นสัดเช่นเดียวกัน คือ สภาวะสรีรวิทยาของมดลูกทั้งของแม่ตัวให้และแม่ตัวรับต้องเหมือนหรือใกล้เคียงกัน ตัวอ่อนจะได้ฝังตัวที่มดลูกแม่ตัวรับและตั้งท้อง สภาวะของมดลูกแม่ตัวให้และแม่ตัวรับที่เหมือนกันในวันย้ายฝากตัวอ่อนมีความสำคัญมากต่อการตั้งท้อง แม่ตัวรับจะรับสัญญานว่าตั้งท้องหรือไม่ในวันที่ 17 ของวงจรการเป็นสัดโดยตัวอ่อนจะผลิตสารพวกโปรตีนซึ่งจะทำปฏิกิริยากับตัวรับ(receptor) ของมดลูก เพื่อยั้บยั้งการหลั่ง PGF2∝ ทื่จะไปทำให้ CL ฝ่อสะลาย เมื่อ CL ไม่ฝ่อสะลายสภาวะของมดลูกก็เหมาะกับตัวอ่อนที่จะเจริญเติบโตต่อไป ถ้าสภาวะของมดลูกกับตัวอ่อนไม่สอดคล้องกัน เช่น ตัวอ่อนอาจผลิตสารก่อนเวลาอันควร ร่างกายก็ไม่ตอบรับหรือตัวอ่อนที่ไม่เจริญและไม่ผลิตสารสัญญานออกมาก็ไม่เกิดการตั้งท้องเช่นกัน
                ความแตกต่างของวงจรเป็นสัดระหว่างแม่ตัวให้และแม่ตัวรับไม่ควรต่างกันเกิน 24 ชั่วโมง อย่างไรก็ตามต้องดูอายุของตัวอ่อนด้วยว่าอยู่ที่ประมาณวันที่เท่าไร ซึ่งดูได้จากการเจริญของตัวอ่อน เช่น ตัวอ่อนระยะมอรูล่าจะอายุประมาณ 5-6 วัน ก็ควรใช้แม่ตัวรับที่เป็นสัดมาแล้ว 5-6 วันเช่นกันหรือหากไม่มีควรเลือกแม่ตัวรับที่เป็นสัดหลังตัวให้ 12 ชั่วโมง หรือก่อน 12 ชั่วโมง ในธรรมชาติอาจเป็นการยากในทางปฏิบัติที่แม่ตัวรับในฝูงจะเป็นสัดพร้อมกันตามที่เราต้องการแต่เราสามารถเหนี่ยวนำให้แม่ตัวให้และแม่ตัวรับเป็นสัดตามที่เรากำหนดเวลาได้โดยการใช้ฮอร์โมนเหนี่ยวนำการเป็นสัด
          หลักการทั่วไปในการเหนี่ยวนำการเป็นสัด คือ การทำให้ CL ฝ่อไปโดยการใช้ฮอร์โมน PGF2∝ ซึ่งมีฤทธิ์สะลาย CL ได้ซึ่งเป็นสิ่งที่เกิดขึ้นในวงจรการเป็นสัดปกติอยู่แล้วเมื่อ CL มีอายุประมาณวันที่ 17 ของวงจรการเป็นสัด
               PGF2∝ ที่ใช้จะต้องใช้เมื่อ CL มีอายุประมาณวันที่ 6-10 ของวงจรการเป็นสัด แม่โคจะแสดงอาการเป็นสัดประมาณ 2-5 วันหลังฉีด แต่ถ้าไม่ทราบวงจรการเป็นสัดก็อาจฉีด 2 ครั้งห่างกัน 11 วัน
               การใช้ฮอร์โมนโปรเจสเตอโรน (Progesterone) โดยมีหลักการ คือ โปรเจสเตอโรนจะไปกดการหลั่งฮอร์โมน Gonadotropin (FSH,LH) จากต่อมใต้สมอง ซึ่งจะทำให้ไม่มี LH (Luteinizing hormone) มาเลี้ยงการเจริญคงอยู่ของ CL โดยใช้โปรเจสเตอโรนนาน 9-10 วัน CL ก็จะฝ่อไป โปรเจสเตอโรนที่ใช้อาจใช้ในรูปแบบฝัวหู เช่น Synchromet-b หรือแบบสอดช่องคลอด เช่น CIDR-B เมื่อถอดโปรเจนเตอโรนออก ฮอร์โมน Gonadotropin (FSH) ก็จะหลั่งออกมาซึ่ง FSH จะมีผลไปกระตุ้นให้ follicle เจริญเติบโตภายใน 24-36 ชั่วโมง

โปรแกรมเหนี่ยวนำการเป็นสัดในแม่โคตัวรับ

การเก็บตัวอ่อน (Embryo collection)
         เมื่อมีการตกไข่และเกิดการปฏิสนธิที่ส่วน ampulla ของท่อนำไข่จากนั้นไข่ที่เกิดปฏิสนธิแล้วหรือตัวอ่อน (embryo) ก็จะเคลื่อนที่มาอยู่ที่ส่วน isthmus ของท่อนำไข่ ผ่านส่วนต่อของท่อนำไข่กับปีกมดลูกและเข้าสู่ส่วนต้นของปีกมดลูกตามลำดับ ซึ่งขณะเคลื่อที่นั้นก็มีการแบ่งตัวพัฒนาการตามระยะต่าง ๆ ตามลำดับ

การพัฒนาการของตัวอ่อนระยะต่าง ๆ

               โดยทั่วไปตัวอ่อนจะคงอยู่ในท่อนำไข่ประมาณ 4 วันหลังการปฏิสนธิและเข้าสู่ส่วนต้นของปีกมดลูกประมาณวันที่ 5-6 ดังนั้นถ้าจะเก็บตัวอ่อนผ่านทางมดลูกจะกระทำได้ตั้งแต่วันที่ 5 หลังการปฏิสนธิ แต่โดยทั่วไปในโค กระบือจะเก็บในวันที่ 6-8 หลังปฏิสนธิ ซึ่งตัวอ่อนจะเจริญถึงระยะมอรูล่า (morula)หรือบลาสโตซีส (blastocyst)
 

embryo ระยะ morula	embryo ระยะ blastocyts

วิธีการเก็บตัวอ่อนในโค กระบือ มี 2 วิธี คือ
               1.การเก็บตัวอ่อนแบบผ่าตัด (surgical embryo collection)
               2.การเก็บตัวอ่อนแบบไม่ผ่าตัด (non surgical embryo collection)

               การเก็บตัวอ่ออนแบบผ่าตัด ปัจจุบันวิธีนี้ไม่เป็นที่นิยมเนื่องจากมีขั้นตอนยุ่งยากและใช้เวลามากและมีโอกาสเกิดการยึดติดของอวัยวะสืบพันธุ์กับเยื่อบุช่องท้อง
               การเก็บตัวอ่อนแบบไม่ผ่าตัด โดยเก็บผ่านมดลูก ปัจจุบันนิยมปฏิบัติโดยทั่วไป ซึ่งดำเนินการโดยท่อเก็บตัวอ่อนที่เรียกว่า foley catheter มีขั้นตอนดังนี้
               1.ล้วงตรวจรังไข่ผ่านทางทวารหนักเพื่อประเมินการตอบสนองต่อการกระตุ้นการตกไข่และนับจำนวนและลักษณะของ CL
               2.สอด foley catheter เข้าในปีกมดลูกตรงตำแหน่ง bifurcation แล้วเติมอากาศเข้าลูกโป่งที่ foley catheter ให้มีขนาดพอเหมาะกับขนาดของโพรงปีกมดลูก
          3.ปล่อยน้ำยาชะล้างตัวอ่อนเข้าในปีกมดลูกให้เต็มแล้วปล่อยออก เพื่อให้ตัวอ่อนไหลออกมากับน้ำยาชะล้าง ทำซ้ำหลาย ๆ ครั้งจนแน่ใจว่าตัวอ่อนถูกชะล้างออกมาหมด ปกติจะใช้น้ำยาประมาณครึ่งลิตร และทำการชะล้างเช่นเดียวกันกับปีกมดลูกอีกข้าง
               4.ตัวอ่อนที่ไหลออกมากับน้ำยาชะล้างจะถูกเก็บไว้ในถ้วยกรองที่รองรับ และนำไปถ่ายใส่จานทดลองพลาสติกตรวจหาตัวอ่อนด้วยกล้องจุลทรรศน์สเตริโอ (stereomicroscope)  เพื่อประเมินคุณภาพตัวอ่อน ก่อนนำไปถ่ายฝากให้แม่ตัวรับหรือนำไปแช่แข็ง
               5.หลังจากเก็บตัวอ่อนเสร็จแล้วควรฉีดยาปฏิชีวนะเข้ามดลูกเพื่อป้องกันการติดเชื้อและฉีด PGF2∝ สะลาย CL ในแม่ตัวให้เพื่อป้องกันการตั้งท้อง

การเก็บตัวอ่อนโดยใช้ foley catheter

 

ตำแหน่ง foley ที่ปีกมดลูก

การถ่ายตัวอ่อนลงจานทดลอง             การตรวจตัวอ่อนด้วยกล้องสเตอริโอ

การประเมินคุณภาพตัวอ่อน (embryo evaluation)

         เมื่อค้นพบตัวอ่อนจากน้ำยาเก็บตัวอ่อนแล้ว จะต้องเก็บตัวอ่อนลงในน้ำยาเก็บตัวอ่อน (culture medium) ในจานทดลองขนาด 3.5 x 10 mm. ตัวอ่อนที่ได้จะมีคุณภาพหลากหลายแตกต่างกัน ดังนั้นจึงจำเป็นต้องประเมินคุณภาพตัวอ่อนที่เหมาะสมที่จะนำไปย้ายฝากให้แม่ตัวรับหรือนำไปแช่แข็ง การประเมินจะใช้กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ กำลังขยาย 10-40 เท่า หรืออาจใช้กล้องจุลทรรศน์ชนิด inverted microscope ก็จะมีประสิทธิภาพดียิ่งขึ้น เพราะมีกำลังขยายมากขึ้น ลักษณะของตัวอ่อนที่ใช้ในการประเมิน คือ
               1.ระยะพัฒนาการของตัวอ่อน (embryonic development stage)
               2.รูปร่างลักษณะของมวลเซลล์ตัวอ่อน (morphology)

ระยะพัฒนาการของตัวอ่อน (embryo development stage)
         หลังการปฏิสนธิตัวอ่อนจะมีการแบ่งเซลล์และพัฒนาเป็นลำดับ ที่เวลาประมาณ 48 ชั่วโมงหลังปฏิสนธิ ตัวอ่อนจะแบ่งตัวเป็น 2 เซลล์ ในวันที่ 3 จะมีประมาณ 8 เซลล์หรือมากกว่า วันที่ 5 จะมีประมาณ 16-32 เซลล์ จึงจะเข้าสู่ระยะ morula ในวันที่ 7 จะมีช่องในกลุ่มมวลเซลล์เป็นระยะ blastocyst หลังจากนั้นเซลล์จะแบ่งตัวมากขึ้นเจริญไปเป็น expland blastocyst และหลุดออกจาก zona pellucida (hatched blastocyst) ในประมาณวันที่ 9-11 เนื่องจากการเก็บตัวอ่อนจะทำประมาณวันที่ 6-8 หลังผสมเทียม ดังนั้นพัฒนาการของตัวอ่อนที่เก็บได้ควรอยู่ในระยะ morula หรือ blastocyst ถ้าตัวอ่อนที่เก๋บได้ไม่อยู่ในระยะดังกล่าวแสดงว่ามีความผิดปกติในการแบ่งตัวหรือไม่มีการปฏิสนธิเกิดขึ้น (unfertilization ovum ; UFO)

การพัฒนาการของตัวอ่อนระยะต่าง ๆ หลังปฏิสนธิ

รูปร่างลักษณะของมวลเซลล์ตัวอ่อน (morphology)

               ตัวอ่อนที่มีคุณภาพดีต้องมี zonzpellucida มีรูปทรงของมวลเซซล์เป็นทรงกลม สมมาตร ส่วนของ cytoplasm ปกติสีไม่เข้มหรือจางเกินไป ดังนั้นจึงประเมินคุณภาพตัวอ่อนเป็นเกรดต่าง ๆ ดังนี้
               1.คุณภาพเกรด A (A grade,excellent) ตัวอ่อนคุณภาพดีมาก มีพัฒนาการปกติ มีรูปทรงกลม สมมาตร เซลล์เกาะกันแน่นไม่มีเซลล์แตก สีของเซลล์ตัวอ่อนกลมกลืน

               2.คุณภาพเกรด B (B grade,good) ตัวอ่อนคุณภาพดี มีพัฒนาการปกติ รูปทรงกลมหรือบิดเบี้ยวเล็กน้อยแต่เซลล์เกาะกันแน่น มีเซลล์แยกออกจากกลุ่ม 10-20 % สีของเซลล์ตัวอ่อนกลมกลืน

               3.คุณภาพเกรด C (C grade,fair) ตัวอ่อนคุณภาพพอใช้ มีพัฒนาการปกติ อาจไม่เป็นทรงกลมแต่เกาะกันแน่น มีเซลล์แยกออกจากกลุ่ม 30-40 %  สีของเซลล์ตัวอ่อนส่วนที่เกาะกลุ่มสม่ำเสมอ

          4.คุณภาพเกรด D (D grade,poor/degenerate) ตัวอ่อนคุณภาพไม่ดี มีเซลล์เสื่อมสะลายมาก มีเซลล์เกาะกันแน่น น้อยกว่า 40 % การพัฒนาการช้า หยุดเจริญ หรือไข่ที่ไม่ได้รับการผสม

               ตัวอ่อนสด (fresh embryo) เกรด A,B,C เท่านั้นที่เป็นตัวอ่อนที่มีคุณภาพสามารถนำไปย้ายฝากให้แม่ตัวรับได้ และตัวอ่อนสด เกรด A และ B เท่านั้นที่เป็นตัวอ่อนคุณภาพที่สามารถนำไปแช่แข็งได้

morula-A	morula-A	blastocyst-A
morula-B	blastocyst-B	blastocyst-B
morula-C	blastocyst-C	morula-C
unfertilized ovum	degenerate	degenerate

การแช่แข็งตัวอ่อน (embryo cryopreservation)

               หลักการแช่แข็งตัวอ่อน  ตัวอ่อนประกอบด้วยเซลล์จำนวนหนึ่งที่ถูกหล่อเลี้ยงด้วยของเหลวหรือน้ำเลี้ยงตัวอ่อนเสมอ ซึ่งเป็นส่วนของเหลวนอกเซลล์  เมื่อทำให้อุณหภูมิลดลงเรื่อย ๆ ความเข้มข้นของของเหลวจะเพิ่มขึ้น (osmolality เพิ่มขึ้น) น้ำภายในเซลล์ตัวอ่อนจะออกมานอกเซลล์เพื่อรักษาสมดุลย์ โดยเฉพาะเมื่อของเหลวภายนอกเซลล์ใกล้แข็งตัว น้ำภายในเซลล์จะออกมานอกเซลล์มากขึ้นเรื่อย ๆ ในที่สุดของเหลวทั้งหมดจะแข็งตัวด้วยความเย็น เกิดเป็นผลึกน้ำแข็งภายนอกเซลล์และถ้ามีน้ำเหลืออยู่ในเซลล์ก็จะเกิดผลึกน้ำแข็งด้วย
               ในการเกิดผลึกน้ำแข็งถ้าเกิดมากหรือผลึกมีขนาดใหญ่มากก็จะทำให้เกิดความเสียหายแก่เซลล์ เช่นผนังเซลล์ โครงสร้างและออร์กาเนลต่าง ๆ ภายในเซลล์ ดังนั้นเพื่อป้องกันการเกิดความเสียหายต่อเซลล์ ต้องป้องกันให้เกิดผลึกน้ำแข็งน้อยที่สุดในขณะแช่แข็งตัวอ่อน เช่น โดยการลดอุณหภูมิลงช้า ๆ หรือทำให้เซลล์ผ่านสภาพ osmolality ให้เร็วที่สุดด้วยการลดอุณหภูมิอย่างรวดเร็ว และการใช้สารป้องกันการแช่แข็ง (cryoprotectant) ซึ่งจะทำให้เกิดแรงดัน osmosis ที่เหมาะสม

ประโยชน์ของการแช่แข็งตัวอ่อน

               1.ใช้เก็บรักษาตัวอ่อนไว้รอการย้ายฝาก
               2.สะดวกในการขนส่ง ทำให้การแพร่กระจายและการปรับปรุงพันธุ์ให้ดีขึ้น และเอื้ออำนวยในเชิงพานิชน์
               3.ทำให้การควบคุมโรคติดต่อทางระบบสืบพันธุ์ได้อย่างมีประสิทธิภาพ
               4.ใช้เก็บรักษาพันธุกรรมของสัตว์ที่พันธุกรรมดีเลิศ หรือสัตว์ใกล้สูญพันธุ์

วิธีการแช่แข็งตัวอ่อน มี 2 วิธี คือ

                1.การแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิช้า (conventional slow freezing)
                2.การแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิเร็ว (vitrification)

การแช่แข็งแบบลดอุหภูมิช้า

               เมื่อทำการแช่ตัวอ่อนในน้ำยาที่มีสารป้องกันการแช่แข็งแล้ว บรรจุตัวอ่อนใส่หลอดบรรจุตัวอ่อนแล้ววางลงในเครื่องแช่แข็งอัตโนมัติที่สามารถปรับอัตราการแช่แข็งได้ตามโปรแกรมที่กำหนด โดยทั่วไปจะลดอุณหภูมิจนถึง -4 °c หรือ -7 °c เป็นการเหนี่ยวนำให้เกิดผลึกน้ำแข็ง (seeding) แล้วปล่อยให้อุณหภูมิลดลงต่อถึงประมาณ -35 °c จึงนำหลอดบรรจุตัวอ่อนลงแช่ในไนโตรเจนเหลวที่มีอุณหภูมิ -196 °c
               สารป้องกันการแช่แข็งโดยทั่วไปแบ่งเป็น 2 ชนิดคือ ชนิดที่ซึมผ่านเข้าเซลล์ได้ง่าย และชนิดที่ไม่ซึมผ่านเข้าเซลล์ ก่อนแช่แข็งตัวอ่อนต้องนำตัวอ่อนแช่ในน้ำยาที่มีสารป้องกันการแช่แข็ง มีวิธีทำ 2 วิธี คือ
               1.แบบทีละขั้น (step wise) เป็นการแช่ตัวอ่อนในน้ำยาที่มีสารป้องกันการแช่แข็งทีละความเข้มข้น เริ่มจากความเข้มน้อยไปหาความเข้มข้นมาก เช่น เริ่มแช่ในสารละลายที่มีกลีเซอรอล 0.25 M ไปจนถึง 1.0 M ในเวลาที่กำหนด ขั้นละ 5 นาที
                2.แบบขั้นเดียว (one step) เป็นการแช่ตัวอ่อนในน้ำยาทีมีสารป้องกันการแช่แข็งชนิดที่เหมาะสมในความเข้มข้นเดียวเป็นเวลา 10-30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง
           การละลายตัวอ่อน (thawing) โดยการแช่หลอดบรรจุตัวอ่อนลงในน้ำอุ่นที่มีอุณหภูมิประมาณ 32-37 °c นาน 10-30 นาทีจากนั้นตัดหลอดบรรจุตัวอ่อนปล่อยให้สารละลายและตัวอ่อนที่อยู่ในหลอดไหลลงในจานทดลองและทำการดึงสารป้องกันเซลล์จากกระบวนการแช่แข็งออก ถ้าใช้วิธีการแช่แข็งแบบทีละขั้น (step wise) ก็ต้องดำเนินการต่อด้วยการละลายทีละขั้น คือผ่านสารละลายที่มีความเข้มข้นลดลงเรื่อย ๆ ส่วนตัวอ่อนที่ผ่านการแช่แข็งแบบขั้นเดียว (one step) ก็นำตัวอ่อนมาดำเนินการต่อในสารละลายซูโครส แต่ถ้าในหลอดแช่แข็งที่เตรียมการล่วงหน้าให้มีส่วนประกอบของซูโครสก่อนแล้วเมื่อละลายแล้วไม่ต้องเทตัวอ่อนจากหลอดสามารถบรรจุใส่ปืนย้ายฝากได้เลยเช่นเดียวกับวิธีการผสมเทียม หรือที่เรียกว่า "one step straw method"

การแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิเร็ว

               หลักการคือ การลดอุณหภูมิลงอย่างรวดเร็ว ประกอบกับการใช้สารป้องการการแช่แข็งที่มีความเข้มข้นสูงแต่ไม่มีการเกิดผลึกน้ำแข็งในเซลล์ซึ่งเป็นข้อดีที่ไม่เกิดความเสียหายต่อเซลล์แต่ต้องดำเนินการอย่างรวดเร็วมิฉะนั้นตัวอ่อนจะสัมผัสกับสารป้องกันการแช่แข็งนานเกินไปซึ่งจะเป็นพิษต่อตัวอ่อน เนื่องจากน้ำยาที่ใช้แช่แข็งมีความเข้มข้นสูงประกอบกับอุณหภูมิที่ลดลงอย่างรวดเร็วเพราะจุ่มลงในไนโตรเจนเหลวจะทำให้น้ำยามีความหนืดมากและเย็นจัดจนเกิดสภาวะคล้ายแก้วได้ แต่จะไม่เกิดผลึกน้ำแข็ง ซึ่งจะทำให่เก็บรักษาตัวอ่อนได้ดี
                ขั้นตอนการแช่แข็งแบบลดอุณหภูมิเร็ว เตรียมน้ำยาแช่แข็ง vitrification พร้อมสารป้องกันการแช่แข็ง นำตัวอ่อนใส่ลงในน้ำยาที่ 1 นาน 5 นาที น้ำยาที่ 2 นาน 5 นาทีและน้ำยาที่ 3 นาน 1 นาที น้ำยาทั้ง 3 ชนิดเก็บไว้ที่อุณหภูมิห้อง  จากน้ำยาที่ 3 รีบถ่ายตัวอ่อนเข้าสู้หลอดบรรจุตัวอ่อน ขนาด 0.25 ml. แล้วนำไปแช่ในไนโตรเจนเหลวกระบวนการนี้ทำให้เสร็จภายใน 1 นาที  ในการแช่ตัวอ่อนลงในไนโตรเจนเหลวให้แช่ด้านที่มีจุกสำลีลงก่อนและแน่ใจว่าส่วนที่บรรจุน้ำตาลซูโครสเยือกแข็งแล้วโดยจะเห็นเป็นสีขาว และส่วนของน้ำยา vitrification (ส่วนที่มีตัวอ่อนอยู่) จะเห็นเป็นส่วนใส
                  การละลายตัวอ่อน (thawing)  จากการแช่แข็งด้วยวิธีนี้ทำได้โดบอุ่นหลอดบรรจุตัวอ่อนในน้ำอุ่นอุณหภูมิ 20°c แล้ววย้ายลงสู่จานทดลอง ซึ่งส่วนที่มีน้ำตาลซูโครสและน้ำยา vitrification จะผสมกันจากนั้นทำการหาตัวอ่อนด้วยกล้องจึลทรรศน์สเตอริโอแล้วย้ายตัวอ่อนลงในสารละลายที่ 1 ที่มี 0.5 M.ซูโครส นาน 5 นาที สารละลายที่ 2 ที่มี 0.5 M.ซูโครส นาน 5 นาที ตามลำดับจากนั้นนำตัวอ่อนมาล้างในน้ำยาเลี้ยงตัวอ่อน (PBS+20% calf serum) 2-3 ครั้ง ตัวอ่อนก็พร้อมที่จะนำไปย้ายฝาก

การย้ายฝากตัวอ่อน (embryo transfer)

                
                  1.วิธีผ่าตัด (surgical transfer)
                  2.วิธีไม่ผ่าตัด (non surgical transfer)

               วิธีผ่าตัด (surgical transfer)   ในยุคต้นของการย้ายฝากตัวอ่อนในโคจะใช้วิธีการผ่าตัด โคต้องได้รับการวางยาสลบและอยู่ในท่านอนหงายและเปิดผ่าในแนวเส้นกลางตัว ต่อมาพัฒนาวิธีการเปิดผ่าทางผนังด้านข้าง (flank incision) โดยการใช้ยาชาที่ไขสันหลังและบริเวณที่จะผ่า ก่อนที่จะทำการฝากตัวอ่อนต้องล้วงตรวจรังไข่แม่โคตัวรับก่อนว่ามี CL คุณภาพดีพอที่จะรับฝากตัวอ่อนหรือไม่และมี CL อยู่บนรังไข่ข้างใด (ซ้าย หรือ ขวา) เพื่อจะด้เปิดผ่าข้างเดียวกับที่มี CL อยู่

               วิธีไม่ผ่าตัด (non surgical transfer) ปัจจุบันการย้ายฝากตัวอ่อนโดยวิธีนี้เป็นที่ปฏิบัติอย่างแพร่หลาย ซึ่งมีวิธีทำดังนี้
               1.ทำการบังคับโคตัวรับในซองบังคับ
               2.ล้วงตรวจรังไข่ทางทวารหนัก เพื่อตรวจประเมินคุณภาพ CL และเพื่อทราบว่า CL อยู่บนรังไข่ข้างซ้ายหรือขวา จะดำเนินการฝากเฉพาะตัวรับที่มี CL คุณภาพดีเหมาะสมเท่านั้น
               3.ฉีดยาชาเข้าไขสันหลังบริเวณโคนหาง (epidural block)
               4.ล้างทำความสะอาดบริเวณอวัยวะเพศภายนอก และเว็ดให้แห้ง
               5.เตรียมตัวอ่อนบรรจุในหลอดและใส่เข้าในปืนย้ายฝากตัวอ่อน สอดปืนย้ายฝากตัวอ่อนให้เข้าและผนคอมดลูกคล้ายการผสมเทียม สอดปืนด้วยความนุ่มนวล
               6.เมื่อผ่านเข้าถึงมดลูกแล้วค่อย ๆ บังคับให้ปืนเข้าสู่ปีกมดลูกข้างที่มี CL อยู่ เมื่อเลยส่วนแยกของปีกมดลูกแล้วให้ยกปีกมดลูกสวมเข้าปืนย้ายฝากตัวอ่อน เพื่อป้องกันอันตรายที่อาจเกิดขึ้นต่อผนังปีกมดลูกเพราะปีกมดลูกส่วนนี้จะโค้งลง และปล่อยตัวอ่อนที่ส่วนโค้งของปีกมดลูก
               7.ปล่อยโคตัวรับให้อยู่เป็นปกติ อย่าให้เครียด และดูแลเป็นพิเศษในช่วง 2 เดือนแรกหลังการย้ายฝากเพรเป็นช่วงสำคัญที่มีความอ่อนไวต่อการฝังตัวของตัวอ่อน อาจทำการตรวจท้องหลังการย้ายฝาก 30 วันด้วยเครื่องอัลตราซาวด์